關鍵字：試劑盒,檢測試劑盒,檢測試紙條,金標檢測卡,速測卡,elisa試劑盒
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一、 原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)和雞肉等組織樣本中的己烯雌酚，在微孔條上預包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的原理來進行的，樣本中的己烯雌酚和微孔條上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚的抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的己烯雌酚含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出己烯雌酚含量。
二、 試劑盒技術指標：
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
樣本檢測下限：
組織（蝦、魚） 0.1ppb
豬肉/肝 雞肉/肝 2ppb
飼料 20ppb
尿液 0.6ppb
回收率：
飼料 90±10%
組織 85±10%
尿液 80±10%
交叉反應率：
己烯雌酚 100%
雙烯雌酚 35%
己烷雌酚 10%
己炔雌二醇 <0.1%
雌三醇 <0.1%
三、試劑盒組成
1．酶標板：96T/8孔
2．標準品液： 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb（1.0mL/瓶）
3．酶標記物 12mL
4．抗體工作液 7mL
5．底物緩沖液 7 mL
6．底物液 7 mL
7．終止液 7 mL
8．20倍濃縮洗滌液 50 mL 用去離子水稀釋到1000 mL
9．20倍濃縮復溶液 12mL 用去離子水稀釋到240 mL
四、樣本前處理步驟
樣本處理前須知：
1．實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
2．實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。
樣本前處理需配制：
配液1：6M H3PO4 100mL 濃H3PO4（含量85%） 加去離子水150mL混合均勻
配液2：1M NaOH 4g NaOH 加去離子水100mL溶解
配液3：2M NaOH 8g NaOH 加去離子水100mL溶解
配液4：乙腈-丙酮 80mL 乙腈 加入丙酮20mL混合均勻
樣本的處理：
（a）飼料樣本
1．稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8mL乙腈，振搖10min，15℃，3000g以上，離心10min；
2．取2mL上清液，60℃氮氣/空氣吹干；
3．加入0.5mL氯仿，渦動20s，加入2mL 1M NaOH，渦動30s，3000g以上，離心5min；
4．取1mL上清液，加入100µL 6M H3PO4，渦動5s；
不同樣本按如下方法稀釋：
配合料：取50µL，加入950µL的復溶液，渦動混勻，取50µL /孔用于檢測。
濃縮料/預混料：取25µL，加入975µL復溶液，渦動混勻，取50µL /孔用于檢測。取50µL用于分析。
配合料稀釋倍數(shù)：100
濃縮料、預混料稀釋倍數(shù)：200
（b）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）
1．稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6mL乙腈-丙酮，振搖10min，15℃，3000g以上，離心10min。
2．取3mL上清液，60℃氮氣/空氣吹干。
加入0.5mL氯仿，渦動20s，加入2mL 2M NaOH，渦動30s，3000g以上，離心5min。
3．取1mL上清液，加入200µL 6M H3PO4，渦動5s。
4．加入3mL乙腈萃取，振蕩10min，室溫3000g以上，離心10min，取上層有機相， 60℃氮氣/空氣吹干。
用1mL復溶液溶解干燥的殘留物。
不同樣本按如下方法稀釋：
蝦魚：直接取50µL水相用于檢測。稀釋倍數(shù)：2
豬肉/肝、雞肉/肝：取50µL水相加入450µL稀釋后的復溶液，渦動均勻；取50µL用于檢測。
稀釋倍數(shù)：20
（c）尿液
1．取2mL尿液到離心管中，室溫3000g以上，離心10min，直至清亮；
2．移取1mL清亮尿液至離心管中，加入1mL 1M NaOH強烈振蕩5min；
3．加入100µL 6M H3PO4，渦動30 s；
4．再加入8mL氯仿進行萃取，振蕩10min。15℃，3000g以上，離心10min；
5．去掉上層的水相，取下層有機相4 mL，60℃氮氣/空氣吹干；
6．用3mL稀釋后的復溶液干燥的殘留物；
取50µL 用于分析。
樣本稀釋倍數(shù)：6
五、操作步驟
1． 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2． 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。
3． 加標準品/樣本50µL /孔，然后加入抗體工作液50µL /孔，再振蕩混勻，用封板膜蓋板，室溫反應30min。
4． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
5． 加入酶標記物100µL /孔，用封板膜蓋板，室溫反應20min。
6． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。
7． 顯色：每孔加入底物緩沖液50µL，再加底物液50µL，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色10min。
8．測定：每孔加入終止液50µL，輕輕振蕩勻，設定酶標儀于450nm處（在20min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值。
六、結果判定
以標準品百分吸光率為縱坐標，以己烯雌酚標準品濃度（ng/mL）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實際濃度。
七、注意事項
1. 終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
2. 不要使用已過有效日期的孔雀石綠檢測試劑盒；不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內(nèi)容不可混用，以免降低靈敏度。
3. 0標準液的A450nm<0.6時，表示試劑可能變質(zhì)，請勿使用。
4. 顯色劑變藍，表明已變質(zhì)，請勿使用。
八、儲藏條件和保質(zhì)期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。 |
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