關鍵字:試劑盒,檢測試劑盒,檢測試紙條,金標檢測卡,速測卡,elisa試劑盒 dbzz1. 原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原,樣本中的孔雀石綠結晶紫和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭孔雀石綠抗體,加入酶標記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠結晶紫的含量成負相關,與標準曲線比較可得出相應孔雀石綠結晶紫的含量。
2. 試劑盒組成
(1) 酶標板: 96 T/8孔
(2) 標準品液:(1.0 mL/瓶)0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb。
(3) 酶標記物: 1瓶(12 mL)。
(4) 抗體工作液: 1瓶(7 mL)。
(5) 底物緩沖液: 1瓶(7 mL)。
(6) 底物液: 1瓶(7 mL)。
(7) 終止液: 1瓶(7 mL)。
(8) 20倍濃縮洗液:1瓶(50 mL)加蒸餾水稀釋到1000 mL。
(9) 1 mg/mL標準品液:(0.2 mL)。
(10) 提取液A (50 mL)
(11) 提取液B (50 mL)
3. 需要但試劑盒中不提供的器材和試劑
(1)設備
…微孔板酶標儀(450 nm)
…均質器
…振蕩器
…離心機
…各種量程的微量移液器
(2)試劑
…蒸餾水
…環(huán)已烷
5. 儲存條件
(1) 2-8 ℃保存,切勿冷凍!
(2) 將不用的酶標板放進原袋中重新密封。
(3) 酶標記物和顯色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
6. 樣品處理
(1) 魚/蝦樣品的準備(稀釋倍數10)
先將魚肉勻質后,稱取0.5 g樣品,加入500 μL的0.125 mol/L(Ph4.5)乙酸緩沖液,200ul的0.25g/mL鹽酸羥胺,300ul的0.05mol/L對甲苯磺酸,震蕩15分鐘使之成勻漿,12000rpm離心5min,然后取上清用PBST稀釋5倍,用作ELISA檢測
(2) 水質樣品(稀釋倍數1)離心后取50µl作ELISA分析。
7. 免疫分析時試劑的準備
(1)注意事項
A)使用之前將所有試劑平衡至室溫。
B)使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
C)在使用中不要讓微孔干燥。
D)EIA分析的重復性,很大程度上取決于洗板的一致性,仔細按照推薦的洗板順序操作是EIA測定程序中的要點。
E)在所有恒溫孵育過程中,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
(2)濃縮洗滌液使用前應根據所需量進行20倍稀釋,即按1mL濃縮洗滌液加入19mL蒸餾水的比例進行稀釋。
8. 標準樣品配制方法:
(1)用稀釋好的洗液將1mg/mL的標準品液稀釋1000倍,變成1000ng/mL,振蕩混勻。
(2)準備5個1 mL瓶子,其中一個加入1000 μL洗液,其余的分別加入600 μL洗液。
(3)在1000 μL洗液瓶子中先吸出4.05 μL的洗液,然后加入4.05 μL的1000 ng/mL標準品,混勻,使其濃度為4.05 ng/mL,作好記號;
(4)再從4.05ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中,使其濃度為1.35 ng/mL,混勻,作好記號;
(5)再從1.35 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中,使其濃度為0.45 ng/mL,混勻,作好記號;
(6)再從0.45 ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中,使其濃度為0.15 ng/mL,混勻,作好記號;
(7)再從0.15ng/mL的瓶子中吸出300 μL加入其中一個600 μL洗液的瓶子中,使其濃度為0.05 ng/mL,混勻,作好記號。
9. 測定程序
(1)將標準品、樣品所需微量反應板(均需2個平行試驗)放在反應架上。
(2)加入50μl的標準液或處理好的樣品到各自的微孔板中。
(3)加入50μl已稀釋的抗體應用液加入微量反應板,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后,室溫下反應20分鐘。
(4)棄去孔中液體,并將微孔板剩余殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液,輕輕振蕩,放置2分鐘,棄去孔中液體,并在吸水紙上拍干,重復5次。
(5)加入100μl酶標記物應用液到微孔板中,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后, 室溫下反應15分鐘。
(6)棄去孔中的液體,并在吸水紙上拍干,每孔注滿稀釋好的洗液,輕輕振蕩,放置2分鐘,棄去孔中液體,并在吸水紙上拍干,重復5次。
(7)加底物緩沖液50μl,再加入底物液50μl,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后,在室溫避光處孵育10分鐘。
(8)加入50μl終止液到微孔板中,混合好在450nm處測量吸光度值,在加入停止液后10分鐘內讀取光度值。
10. 結果
以標準品百分吸光率為縱坐標,以孔雀石綠標準品濃度(ng/mL)的半對數為橫坐標,繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中,從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度,乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中孔雀石綠實際濃度。
11. 測定技術指標
(1) 靈敏度:
孔雀石綠檢測試劑盒的平均檢測下限約為0.01ng/g(0.01ppb)。
(2) 準確度(回收率):回收率為90%±15%。
12. 交叉反應活性
孔雀石綠檢測試劑盒能檢測孔雀石綠及其相似物,它們的結合程度不同。以下表格中展示的是相關值及交叉反映率(%CR),所有濃度均為ppb級。
種類 |
% CR |
孔雀石綠 |
100% |
隱性孔雀石綠 |
<10% |
結晶紫 |
100% |
隱性結晶紫 |
<10% |
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