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檢測范圍：7.8 ng/ml-500 ng/ml

最低檢測限：1.95 ng/ml

特異性：本試劑盒可用于快速檢測環(huán)丙沙星。有一定交叉反應(yīng)。

交叉反應(yīng)： 環(huán)丙沙星100%

           諾氟沙星150%

           氧氟沙星100%

           沙拉沙星130%

          恩諾沙星86%

有效期：6個月

預(yù)期應(yīng)用：ELISA法定量測定牛奶、牛肉、豬肉、羊肉、雞、火雞、魚和蝦中的環(huán)丙沙星殘留量。

說明

1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正�，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。

概述

回旋酶抑制劑分為四種亞群，恩諾沙星（代謝產(chǎn)物：環(huán)丙沙星）和達氟沙星屬于氟奎諾酮，是允許使用的獸用藥物。氟奎諾酮是廣譜抗菌素，廣泛應(yīng)用養(yǎng)殖業(yè)，特別是牛、豬和雞。在過去的幾年里，氟奎諾酮的使用有所增加，大量的奎諾酮類藥物被用于預(yù)防傳染病，特別是在雞、豬和魚/蝦養(yǎng)殖廠。

實驗原理

本試劑盒采用免疫競爭法檢測環(huán)丙沙星。微孔板上包被有抗環(huán)丙沙星抗體。加入環(huán)丙沙星酶結(jié)合物和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離環(huán)丙沙星與環(huán)丙沙星結(jié)合物競爭微量反應(yīng)板上的抗環(huán)丙沙星抗體，沒有結(jié)合的酶結(jié)合物被洗去。再向反應(yīng)孔中加入相應(yīng)反應(yīng)底物TMB，作用一定時間后，結(jié)合的酶結(jié)合物將TMB轉(zhuǎn)化為藍色，轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環(huán)丙沙星呈負相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

試劑盒組成及試劑配制

1.         已包被兔抗三聚氰胺抗體的酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。

2.         標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：2×100ul/瓶。

3.         樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。

4.         辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物（HRP - CPFX）：1×100ul/瓶（1：100）。

5.         辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物稀釋液（HRP –CPFX Diluent）：1×10ml/瓶。

6.         底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。

7.         濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

8.         終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

需要的試劑和器材

1.         標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.         高速離心機

3.         電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.         超聲清洗器

5.         離子交換小柱（PCX）

6.         氮氣吹干儀

7.         干凈的試管和Eppendof管

8.         系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器

9.         蒸餾水，容量瓶等

樣品制備：

牛奶不需要處理；肉、魚、蝦等需均質(zhì)、提取、離心、稀釋。

標(biāo)本的稀釋原則：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶濃度為500 ng/ml，以樣品稀釋液做系列倍比稀釋，分別稀釋500 ng/ml，250 ng/ml， 125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8 ng/ml。樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml。

辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物的稀釋原則：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔50ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物加990ul辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟�有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔�？瞻卓准訕悠废♂屢�100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物工作液。盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)30分鐘-1小時。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.         溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

3.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

4.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

5.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行檢測。

注：

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記環(huán)丙沙星結(jié)合物工作液。

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項

1. 當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。

5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請最后乘以稀釋倍數(shù)。

6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7. 底物請避光保存。

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

9. 本產(chǎn)品適用于大量樣本的快速篩查。由于生物試驗存在人為及不可預(yù)知的影響因素，本試劑盒得到的檢測結(jié)果僅為參考，不能據(jù)此做出任何結(jié)論。

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